用于人血清及血浆中骨钙素的定量检测

北欧生命科学诊断产品有限公司 (Nordic Bioscience Diagnostics A/S) 氨基端和中段骨钙素酶联免疫试剂盒 (N-MID? Osteocalcin ELISA Kit) 只用于体外人血清及血浆中骨钙素的诊断检测。北欧生命科学诊断产品有限公司对未按照本手册所示方法错误使用本试剂盒不予负责。同样，北欧生命科学诊断产品有限公司对由使用本试剂盒的医生或使用者所做结论或诊断，以及其解释所导致的结果不予负责。

Nordic Bioscience Diagnostics A/S
Herlev Hovedgade 207
DK-2730 Herlev
Denmark

1104A

CE

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简介……………………………………………………………………………………
用途……………………………………………………….
使用范围…………………………………………………………….
检测的总结及解释………………………………………………
检测原理………………………………………………………….
注意事项………………………………………………………….
试剂存放………………………………………………………
注意…………………………………………….
材料及试剂………………………………………..
采样……………………………………………………
已提供的材料及试剂…………………………………
所需的仪器及试剂(未提供)………………………………………
实验步骤……………………………………………………………..
实验步骤……………………………………………………..
标本检测范围………………………………………………….
质量控制…………………………………………………..
结果…………………………………………..
结果处理……………………………
结果举例………………………………………..
性能特性…………………………………
预期值…………………………………
参考文献………………………………………….

简介

用途
氨基端和中段骨钙素酶联免疫试剂盒(M-MID? Osteocalcin ELISA Kit)用酶联免疫法定量测定人血清和血浆中骨钙素。骨钙素作为成骨细胞活性的指标，有助于骨质疏松的预防。

使用范围
骨钙素值的变化可取决于人的年龄(绝经年数)，生物节律，肾小球的滤清速率和药物治疗持续的时间。
本检测结果应该与用其它诊断方法对患者的临床评估所获得的资料一道使用。所以，不推荐骨钙素值用作骨质疏松在总人口中的筛选。此外，不应仅根据骨钙素值改变药物剂量或停止用药。
当评估后续标本时，应在一天中同一时间采集同类型标本，如血清或抗凝血浆作为基线。

检测的总结和解释
骨钙素(OC或BGP)，是骨基质中主要非胶原蛋白质。其分子量大约5800道尔顿，含有49个氨基酸, 包括三个γ-羧基谷氨酸残基。
骨钙素由成骨细胞在骨中合成。合成后部分用于骨基质中，部分进入循环系统。骨钙素的明确生理作用仍不清楚。大量研究显示，骨钙素在循环系统中的水平反映出骨形成的速率(参考文献1?14)。
已证明血清中骨钙素的测定有助于鉴别妇女发展为骨质疏松的危险，有助于监测绝经前和绝经后，以及抗骨吸收治疗中骨的代谢。

检测原理
M-MID? Osteocalcin ELISA 应用两个具有高特异性抗人骨钙素单克隆抗体。识别骨钙素 中部(氨基酸20?29)用生物素标记的抗体用于抗体抗原复合物的捕获，识别氨基端(氨基酸10?16)过氧化物酶加合的抗体用于检测。除完整骨钙素(氨基酸1?49)之外，氨基端-中部片段(氨基酸1?43) 同时被检测。
标准、参比和待测标本加入包被有链霉抗生物素蛋白(streptavidin)的微孔板中，然后加入生物素标记的抗体和过氧化物酶加合的抗体的混合物。室温温育2个小时后洗涤微孔板，加入生色底物。加入硫酸终止显色反应，并测量吸光度。

注意事项

实验室中应注意以下事项：
? 不要在操作免疫诊断试剂室内吃、喝、吸烟或使用化妆用品。
? 不要用口吸取试剂。
? 操作免疫诊断试剂时应带手套。实验完毕将手洗干净。
? 用一次性吸水纸覆盖操作台。

试剂存放
收到氨基端和中段骨钙素酶联免疫试剂盒 (N-MID? Osteocalcin ELISA Kit) 后在2–8 °C 保 存。试剂盒在这此条件下稳定至包装盒上所标有效日期。
重新溶解的标准和参比应在 –18 °C 以下存放，可存放长达 3 个月，只能冻融两次。当抗 体试剂混合后，剩余混合物应存放在 2?8 °C，存放应不超过1个月，不要在 –18 °C 以下 冻结。其它剩余试剂以及微孔板应在 2?8 °C保存。

注意
只用于体外检测
? 所有试剂和实验室设备应按感染物品处理和丢弃。
? 试剂盒应在有效期限之内使用，不要将不同批号的试剂混合。

材料及试剂

采样
静脉取血样，避免溶血。采样后 3 小时内分离血清。建议立即冻结标本 (<–18°C )
当分析血浆标本时，应加入抗凝血素和EDTA。

提供的材料及试剂
打开试剂盒前，请阅读注意事项。本试剂盒提供足够96个标本的测试试剂。将冷冻干燥的试剂溶解在适量蒸馏水中，混合前放置 10 分钟，避免出现泡沫。

包被有链霉抗生物素蛋白(Streptavidin) 的微孔板 (MTP)
条形微孔板 (12 条 x 8 管) 包被有链霉抗生物素蛋白，并置于一塑料框架中。

骨钙素标准A (瓶A)
一瓶含有蛋白质稳定剂和防腐剂的磷酸缓冲盐溶液的冷冻干燥品。将标准A溶于5.0 毫升蒸馏水中。标准A用后必须在低于–18 °C存放。

骨钙素标准B一标准F (瓶B一瓶F)
五瓶含有合成人骨钙素、蛋白质稳定剂和防腐剂的磷酸缓冲盐溶液的冷冻干燥品。将各标准标本溶于 5.0 毫升蒸馏水中。准确浓度标在瓶上。标准标本用后必须在低于–18 °C存 放，只能冻融两次。

骨钙素参比CO(瓶CO)
一瓶含有合成人骨钙素、蛋白质稳定剂和防腐剂的磷酸缓冲盐溶液的冷冻干燥品。将参比标本溶于5.0 毫升蒸馏水中。参比CO用后必须在低于–18 °C存放，只能冻融两次。请参考所附数据表中参比CO的浓度范围。

过氧化物酶加合抗体 (1号瓶)
一瓶(0.25毫升)过氧化物酶加合鼠抗骨钙素氨基端特异单克隆抗体浓缩液(溶于含蛋白质稳定剂和防腐剂的TRIS缓冲溶液)。用前请用加合物稀释液(3号瓶)10毫升稀释。

生物素标记的抗体 (2号瓶)
一瓶(0.25毫升)生物素标记的鼠抗骨钙素中部特异单克隆抗体浓缩液(溶于含蛋白质稳定剂和防腐剂的TRIS缓冲溶液)。用前请用加合物稀释液(3号瓶)10 毫升稀释。

加合物稀释液 (3号瓶)
一瓶( 至少22 毫升)含有蛋白质稳定剂，去污剂和防腐剂的磷酸缓冲盐溶液。

底物溶液 (瓶TMB)
一瓶( 至少12 毫升)可直接使用的四甲基联苯胺(TMB)底物(溶于酸性缓冲溶液)。
请注意该生色底物可带浅蓝色。

终止液 (瓶ST)
一瓶( 至少12 毫升)可直接使用的硫酸溶液。

洗涤溶液 (瓶W)
一瓶(至少20毫升)含有去污剂和防腐剂的浓缩洗涤缓冲溶液，用前以1体积浓缩洗涤缓冲溶液+50体积蒸馏水的比例稀释。

密封薄膜
温育时用粘性密封薄膜密封微孔板。

所需的仪器及试剂(未提供)
? 盛装抗体混合溶液和洗涤溶液的容器。
? 准确移取20微升的微量移液器
? 蒸馏水
? 准确移取100和150微升的8孔或12孔微量移液器
? 450nm和650nm微孔板读数仪

实验步骤

按照下面说明所示进行实验对最佳完成实验非常重要

实验步骤
在使用之前，平衡所有溶液至室温。反应均在18?22°C进行。

确定分析用微孔板所需数量。建议每一标本测试两份。另外，每轮实验共需要14 管用于标准A一标准F和参比CO。

将适当数量的微孔板置于塑料框架上。将未使用的微孔板与干燥剂一起密封于锡箔袋中。

1. 制备抗体混合溶液：
1) 向过氧化物酶加合抗体溶液(1号瓶)和生物素标记的抗体溶液(2号瓶)各加入10毫升加合物稀释溶液(3 号瓶)。
2) 等体积混合两抗体溶液。

2. 温育微孔板
移取20微升标准标本(瓶A?瓶F)，参比CO(瓶CO)和待测标本，加入150微升混合的抗体溶液，用粘性密封薄膜密封微孔板，在18-22°C温育120±5分钟，不要震荡混合。

3. 洗涤微孔板
洗涤缓冲溶液(瓶W)以1体积浓缩缓冲溶液+50体积蒸馏水的比例稀释。手工洗涤微孔板5次。使用自动洗涤器，请参照产品说明或实验室指南。通常洗涤5次。确保每次手工或自动洗涤器洗涤后将微孔板中的溶液倒空干净。

4. 与生色底物温育
向各孔加入100微升底物溶液(瓶TMB)，用粘性密封薄膜密封，在18-22°C且避光的条件下温育15±2分钟(不要混合震荡)。不要直接从盛TMB底物的小瓶吸取，将所需体积的TMB移入一干净容器使用。剩余底物应丢弃，不要倒回 TMB 瓶中。

5. 终止显色反应
向各孔加入100 微升终止溶液(瓶ST)。

6. 测定吸光度
在450nm测定各孔吸光度，用650nm吸光度作参比。应在二个小时之内测定。

标本检测范围
如果待测标本的吸光度高于标准F, 应该用标准A稀释样品并重新分析。

质量控制

合格实验室操作(GLP)要求在每轮实验中使用参比CO以检测实验操作质量。参比CO应以待测标本对待，结果用适当的统计方法分析。

结果

结果的计算
可使用四参数对数曲线的拟合。

也可以计算两个重复标本的吸收平均值，画出六个标准标准(A?标准F)的光吸收对相应骨钙素浓度的标准曲线，依此用内推法确定参比CO和待测标本中骨钙素的浓度。